5.1 基因组测序实验决策

5.1 基因组测序实验决策

本节摘要：基因组测序的决策发生在下单之前：你要找单碱基变异、结构变异、还是组装一个没有好参考的物种？短读长重测序擅长单碱基和短 indel，结构变异和重复区需要长读长或配对末端策略。覆盖度不是越大越体面，是相对变异频率和样品纯度的数学。先写清楚问题，再选文库，否则你会买到一张看不懂也回答不了问题的表。

本节地图

阅读完本节，你应当能够：

1. 区分重测序、从头组装、靶向捕获、宏基因组各自回答什么
2. 用覆盖度和等位基因频率估计低频率变异能不能看见
3. 说明 PCR 重复、GC 偏差、参考基因组漏洞如何制造假变异
4. 在肿瘤纯度、污染、混样被发现时知道先查实验而不是先发新基因

先写问题，再写测序仪型号

“做个全基因组”不是实验设计。找孟德尔病的编码变异，外显子捕获通常更划算。找调控区或结构变异，才需要更全的基因组或长读长。组装新物种，短读长拼重复区会碎，长读长和高准确短读长常要搭配。宏基因组问群落里有谁、有什么基因，个体染色体的相位反而不第一。

把它当成测绘。你要的是门牌号（单碱基）、还是整栋楼拆迁（结构变异）、还是一张从没画过的城市（组装）。门牌号用短读长沿已知地图比对即可；拆迁要用能跨过重复街区的长尺子；新城市不能靠把读段硬贴到别的城市地图上。

决策清单：
  有没有可用参考基因组
  变异类型：单碱基、indel、拷贝数、重排、表观
  样品：单克隆、组织混合物、肿瘤纯度
  预算换成覆盖度还是样本数
  是否需要相位信息
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覆盖度是平均每个碱基被读到几次。孟德尔杂合变异在中等覆盖下通常可见；体细胞低频突变在肿瘤纯度低时会被稀释，需要更高覆盖或富集。公式直觉：期望读到的次数约等于覆盖度乘以该等位基因的真实频率。频率 5%、覆盖 50，期望只有大约 2-3 个读段，很容易被当成噪声滤掉。这时不是算法不善良，是你买的层数不够。

文库步骤在制造系统误差

打断插入片段长度决定你能跳过多远的重复。配对末端提供两个锚点。PCR 扩增文库会让某些 GC 极端区消失或重复，PCR-free 对基因组更诚实也更吃起始量。重复读段来自同一分子的克隆，当独立证据会假升高等位基因频率，必须去重。UMI 独特分子标签能帮你分清“真的很多分子”还是“PCR 复印了很多”。

参考基因组不是真理。缺口、错误、次要单倍型、基因家族塌缩，都会让比对把读段放错家，造出假 SNP 或假缺失。重复区和假基因是重灾区。变异列表必须带质量与注释，并抽一部分用 Sanger 或第二种技术验证，尤其你要拿它做功能结论时。

⚠️ 常见坑：把未去重的深度当成覆盖度，肿瘤突变负荷被 PCR 重复抬上天。
💡 关键直觉：测序读的是文库分子，不是细胞里的染色体。文库偏差写进了你的“基因组”。

污染是基因组学的羞辱教育。实验室间交叉、人员 DNA、试剂微生物基因组，都会出现在表里。阴性对照文库不是浪费。混样索引错误会让样本对调，临床场景是事故。双端索引和小心的液体处理比再买一轮测序便宜。

图 覆盖度与低频变异

工程实践：下单前的质控和下单后的抽查

DNA 完整性对长读长致命，短读长文库也讨厌严重断裂。肿瘤切片的甲醛交联会引入假 C 到 T 一类损伤，分析流程要有损伤感知。数量不够就全基因组 PCR 扩增，会把偏差放大，单细胞基因组尤其严重，解释必须非常钝。

拷贝数和纯度纠缠。肿瘤不是纯细胞系，正常细胞稀释突变，亚克隆让频率进一步散开。没有纯度估计的体细胞列表，很难谈驱动还是乘客。配对正常对照能减去种系变异，没有配对就不要轻易把数据库里没有的位点写成体细胞。

伦理和可识别性：全基因组几乎不可逆地标识个人。知情同意、存储、共享规则在第 6.5 节展开，这里先说技术人也要当数据管理员，不能把 identifiability 当生信细节。

验证：关键位点用正交方法。结构变异看是否有分裂读段和深度支持同时在。只在重复区出现、质量低、方向异常的变异，优先当比对伪影。

问题：要不要上超深度？

钱应优先花在样本设计和纯度上。一个脏样本的超深度，不如三个干净生物学重复更能回答多数生物学问题。临床低频监测除外，那是另一套检测限设计。

问题：长读长可以取代短读长吗？

长读长在结构变异和组装上更强，单碱基准确率历史上较弱，近年明显改善，但仍常与短读长互补。按变异类型混合，比信仰某一平台更像实验。

文库插入片段分布要用电泳或仪器看一眼。太短则配对末端跨距不够，结构变异和重复区更无助；太长则某些平台测序质量掉。捕获文库要看中靶率，中靶低等于钱花在靶外。外显子组对非编码调控变异几乎看不见，讨论增强子突变时不要用外显子组当证据。性别鉴定和近亲污染检测应写进常规 QC，样本对调有时靠这些才能发现。

体细胞突变调用要配对正常。没有配对时，把人群数据库里的多态减掉，仍会把稀有种系当体细胞。肿瘤异质性让频率呈连续分布，硬阈值会切掉亚克隆。报告应给频率和覆盖，而不是只给“检出/未检出”。拷贝数中性的杂合性缺失在短读长深度图上可能不明显，需要杂合 SNP 的等位失衡。这些不是软件彩蛋，是你下单时就要问的分析包。

伦理上，即使研究测序也要有同意。把研究 BAM 文件随手拷给合作者，可能已经越出同意范围。技术负责人不是法务，但要知道“文件能传”不等于“可以传”。第 6.5 节把这一条升格为红线，本节先让做基因组的人习惯把数据当人。

下单表上写清：参考版本、是否要线粒体、是否要 Y 染色体、是否要结构变异调用。默认套餐经常省略你真正要的那一层。覆盖度不是均值能保证每个碱基，低比对区要单独看缺口清单。重复序列的变异用短读长时降级为“不可评估”，不要硬叫。家系分析比单人更能过滤无关变异，设计时就采集，而不是测完再找亲属。肿瘤配对正常组织尽量同一人，否则种系背景不同。污染评估软件要跑，人源交叉并不罕见。阳性对照样本周期性测，看管道是否漂。漂了先修管道，再发新基因。基因组的动手优先，是把缺口和污染写进结果，而不是只把明星变异写进摘要。

覆盖度直方图比均值诚实，长尾低覆盖区才是漏检温床。重复区、极端碱基组成、缺口附近单独列表。家系共分离比预测软件更能缩小候选，设计阶段采集亲属。肿瘤异质性用多区域取样时，每一区都要有纯度估计。没有纯度的频率不能比。污染人源用指纹位点对上预期个体，对不上就是对调或污染。对调比新生物学更常见。把指纹分析写成常规，和测序仪开机一样。伦理同意覆盖再分析，否则不能把研究数据拿去跑新算法发新文。数据有人，算法没有豁免权。

覆盖度均值下面藏着长尾缺口。把缺口列表和重复区不可评估写进报告，比多报几个明星变异更接近基因组学的诚实。指纹核对防对调，对调比新基因常见。低频变异先算覆盖乘频率的期望读段，期望太低就不要硬叫。没有配对正常，不要轻易把数据库未见位点写成体细胞。同意要覆盖再分析。

缺口清单进报告。重复区降级为不可评估。指纹防对调。低频先算期望读段。无配对正常不轻易写体细胞。同意覆盖再分析。均值覆盖下面的长尾才是漏检温床。捕获中靶率要看。PCR重复不当深度。损伤化学会造假碱基，分析要知情。

缺口、不可评估、指纹、期望读段、配对正常、再分析同意，六项写进交付。均值覆盖是广告，长尾才是漏检。捕获看中靶。重复不当深度。损伤会造假碱基。对调比新基因常见。把清单当放行，比把明星变异当放行更像基因组学。

交付六项再核：缺口、不可评估、指纹、期望读段、配对正常、再分析同意。六项缺一不放行明星变异。均值是广告。损伤知情。捕获看中靶。重复去重。对调比新基因常见。数据有人。

覆盖度均值好看，不等于每个区间都够。碱基组成极端区、重复区和同源基因会一起变薄。低频变异声明之前，先看该位点的原始比对，而不是只看变异表上的数字。文库插入长度决定你能否跨过重复，短插入再加深测序也补不回结构信息。

本章回顾

• 问题决定文库：点突变、结构变异、组装、群落不是同一产品。
• 覆盖度乘频率：低频看不见时先算期望读段数。
• 测的是文库：PCR 重复、GC 偏差、损伤都会进表。
• 参考基因组有洞：重复区和假基因要人工怀疑。
• 去重和 UMI：深度不是复印次数。
• 污染和混样：阴性对照和双索引是卫生。
• 关键变异要正交验证：尤其功能结论和临床相关位点。

下一节把相对静态的字母换成动态的 RNA 清单：核糖体不去掉，差异表再漂亮也像在测核糖体。