轨迹分析与拟时序

4.1 轨迹分析与拟时序

本节摘要：轨迹分析把一份"快照"里的连续状态细胞重新排成一条带方向的伪时间轴，回答"细胞沿什么路径在变"。它依赖两个前提——数据覆盖了连续的分化过程、且双联体与应激已被控制——否则会产出漂亮却虚假的路径。本节讲清原理、工具选择与完整的 Scanpy 拟时序流程。

把时间找回来

单细胞测序杀死细胞才能读它，所以每份样本只是一瞬间的人群快照。但分化是连续过程：造血干细胞变成前体、再变成成熟血细胞，路径上每个过渡状态的细胞都会同时出现在样本里——数量足够大时，快照等于把一条时间路径上的所有站点同时拍了下来。轨迹分析（trajectory inference）的思路就是把这些"站点"按转录组相似性重新连起来，给每个细胞算一个进度值：离起点近的靠前、离起点远的靠后。这个进度值与真实时间没有换算关系，所以叫伪时间（pseudotime）——它有序、但不以小时计。

先判断你的数据适不适合做轨迹，比学算法重要。适合的形态是：UMAP 图上细胞呈连续渐变的"流"状（造血、发育、重编程、上皮间质转化），而非离散分块的"岛"状（外周血的成熟细胞类型混合）。后者硬做轨迹，得到的"路径"只是把没有过渡关系的细胞类型串成线，解读起来全是误导。

import scanpy as sc

# 只取参与连续过程的细胞（示例：单核细胞到树突细胞的分化段）
sub = adata[adata.obs["celltype"].isin(["Monocyte", "DC precursor", "DC"])].copy()
sc.pp.pca(sub)
sc.pp.neighbors(sub)
sc.tl.diffmap(sub)                       # 扩散映射：轨迹的骨架空间
sc.tl.dpt(sub, n_branchings=1, n_dcs=10) # 拟时序
sc.pl.umap(sub, color=["dpt_pseudotime"])
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Seurat 生态里常用 Monocle 系列完成同样的事：把 Seurat 对象转成 Monocle 的 cell_data_set，learn_graph 学主图、order_cells 指定起点后输出拟时序。起点（root）的选择是拟时序的第一决策：通常取已知最原始状态的细胞群（如造血数据里的造血干细胞），起点选错整条时间轴就反了方向——这是拟时序结果必须人工核验的第一处。

图：从快照到拟时序

工具地图与 RNA velocity

轨迹工具比任何其他单细胞分支都多，但可以按"用谁的信息定方向"归成三类。第一类只用当前表达谱：Monocle 系列在降维空间学一条主图再排序，扩散拟时（DPT）沿扩散映射的成分排序，Slingshot 沿主曲线排——这类方法假设"转录组相似度顺序即时间顺序"，多数场景够用。第二类引入图拓扑：PAGA 把粗粒度的群间连通性算出来，先看"群与群之间有没有过渡通道"再谈排序，适合与上述方法组合使用。第三类借用新的分子证据：RNA velocity（RNA 速率）比较每个基因的剪接与未剪接读段比例——未剪接分子富集意味着该基因正在上调、细胞正走向表达它更高的状态，从而给路径装上方向箭头；scVelo 的动态模型是当前的主流实现。

方向是轨迹解读的生命线，所以 RNA 速率值得当第二意见：常规拟时序定顺序、速率检验方向，两者一致时结论才敢写进论文。注意速率分析对测序深度与内含子注释敏感，图谱类浅测序数据上噪声不小，参考价值打折扣。

假轨迹的三种来源

轨迹分析翻车有固定剧本。第一种是双联体驱动的假过渡：嵌合细胞的表达谱恰好在两类细胞之间，轨迹算法把它们连成"过渡态"，于是 A 型到 B 型的"直接分化"路径凭空出现——回看 3.2 节的剔除记录与群间桥位置的检查，是唯一的防线。第二种是应激驱动的假连续：解离应激基因让所有细胞类型共享一层"应激轴"，轨迹会误把它当成主干；看拟时序与应激得分的相关性，高相关即警报。第三种是起点选错导致方向颠倒：拟时序与已知时序标记（比如发育数据的胚胎日龄、造血数据的干性得分）对照一遍，反向就重选起点。三条防线共同的底层逻辑是：轨迹是解释，不是事实——它必须与独立的生物学证据（时序标记、谱系示踪、时间梯度样本）交叉验证后才算数。

沿途的基因与事件：轨迹的第三层产出

拟时序坐标之外，轨迹分析还有一层常被忽略的产出：沿时间轴的表达变化。做法是把细胞按拟时序排成一列，对每个基因拟合表达随伪时间的平滑曲线，找出"随时间上升""下降""分支特异性"的基因——这些就是路径上的分子事件。再往上一层，把上升基因送进 4.3 节的富集分析，能把"这条路径上发生了什么"从基因名单升级成通路叙事（比如早期富集细胞周期、晚期富集基质互作）。分支处的差异比较（两个命运分支的细胞在分歧点附近的表达差）则是命运决定基因的候选来源，与 4.2 节的调控网络分析天然衔接：分支差异基因里富集的转录因子结合基序，就是命运主控的线索。

常见疑问两则

拟时序能换算成真实时间吗

单靠转录组不能——伪时间只是转录状态的排序，与钟表时间没有内在换算。有真实时间锚点时可以间接校准：多时间点采样（第几天、第几周）给快照盖上时间戳，把每段拟时序锚定在真实时间轴上，甚至能估算细胞状态转换的速率。没有时间梯度时，只能靠已知的时间依赖事件（比如某标记只在特定发育日表达）做粗略标定，解读时要明确标注"这是推断的时间顺序，不是测量的小时数"。

PAGA 与 UMAP 有什么区别

两者都基于邻居图，回答的问题不同。UMAP 把图压成二维给人看，边与距离都是变形过的视觉近似；PAGA（分区图抽象）把图粗粒化成"群与群之间的连通性网络"——它问的是哪两个 cluster 之间存在持续的细胞过渡、哪些群之间根本没有通道。做轨迹前先看 PAGA 图是值得养成的习惯：连通骨架清晰的样本适合继续排拟时序，连通性散乱的样本（各群互不相连）说明数据是离散混合，硬排出来的路径不可信。一句话分工：PAGA 判断"有没有路"，拟时序决定"路有多长、往哪走"。

本节要点回顾

• 拟时序是排序不是时钟：有序但无小时刻度，起点选择决定方向，必须人工核验。
• 数据形态先行判断：连续流状数据才适合轨迹，离散岛状硬做就是自欺。
• 方向要第二意见：RNA 速率提供方向证据，与拟时序一致才可下结论。
• 假轨迹三来源：双联体、应激轴、起点错位——防线全在第三章与起点的核验里。

轨迹回答"细胞在变成什么"，下一个问题是"细胞之间此刻在交流什么"。配体受体共表达如何变成一张信号网络，这是下一节的主题。