空间转录组学实操入门

5.2 空间转录组学实操入门

本节摘要：空间转录组在保留组织切片位置信息的前提下测基因表达，两大技术路线各有取舍——点阵式测全转录组但每点混有多个细胞，原位式达到单细胞甚至亚细胞分辨率但只测预设的几百个基因。本节讲平台选型、最小分析流程，以及空间证据如何反过来修正解离数据的结论。

把位置留下来

肿瘤学里有个经典尴尬：解离数据显示某样本有大量细胞毒性 T 细胞浸润，疗效却很差——空间数据揭开谜底，T 细胞全被挡在肿瘤团块外围的基质层里，根本没有接触肿瘤细胞。位置不只是附加信息，它常常就是机制本身：信号的传递依赖相邻，生态位的形成依赖空间组织。空间转录组把表达测量做在组织切片上，每个数据点自带切片上的坐标，位置从此成为可分析的变量。

图：解离数据与空间数据的互补

两条平台路线的取舍

点阵式平台的代表思路是把组织切片贴在布满捕获点的芯片上，每个点（直径五十五微米量级，覆盖一到十个细胞）捕获该区域的 mRNA，测的是全转录组，并同步拍一张染色图像供形态学参照。它的短板是"点不是细胞"——每点的信号是多个细胞的混合，分析时要么把点当作空间最小单元直接聚类（得到"组织学区域"级别的结论），要么用解卷积方法把每点拆成细胞类型构成。原位路线反其道而行：用编码探针在组织原位逐分子成像，分辨率到单细胞甚至亚细胞，但只能测预先设计的基因面板（几百个基因起步，扩展到上千）。选型的判断式：要无偏的全转录组与区域级图谱选点阵式，要细胞级精度与明确假设（比如只关心免疫检查点相关基因）选原位式；预算充足且问题重要时两者互补——先用点阵式画区域地图，再在关键区域用原位式放大。

最小分析流程

空间数据的分析骨架与第三章同源，只是多了坐标维度。以点阵式数据为例的 Python 主干：

import scanpy as sc
import squidpy as sq

adata = sq.read.visium("spaceranger_output/")   # 点 × 基因 + 空间坐标 + 图像
adata.var_names_make_unique()
adata.var["mt"] = adata.var_names.str.startswith("MT-")
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, qc_vars=["mt"],
                           percent_top=None, log1p=False, inplace=True)

sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4)
sc.pp.log1p(adata)
sc.pp.pca(adata); sc.pp.neighbors(adata); sc.tl.leiden(adata, resolution=0.5)

sq.gr.spatial_neighbors(adata, coord_type="grid")   # 把坐标织成空间邻居图
sq.gr.nhood_enrichment(adata, cluster_key="leiden") # 哪些群在空间上相互 enriched
sq.pl.spatial_scatter(adata, color="leiden")        # 带坐标的表达图谱
​

squidpy 是空间分析的 Scanpy 姊妹包，上面这段就是全转录组点阵数据从读取到邻域分析的完整主干。质控指标与解离数据一致（每点基因数、线粒体比例），但阈值要按平台重估——组织切片上的点天然带着更多环境 RNA，指标分布与液滴数据不同，照搬经验值会错杀。邻域富集（nhood enrichment）是空间分析最"物有所值"的第一步：它检验哪两类点在空间上抱团，是第四章通讯分析缺的那半张证据。

空间数据怎么反哺单细胞图谱

两条互补用法值得单独强调。其一，解卷积映射：用第三章注释好的单细胞图谱当参考，估计每个空间点里各细胞类型的构成（常用工具 cell2location、RCTD），得到"单细胞精度的类型注释 + 空间坐标"的合成图谱——这是当前文献的主流组合拳。其二，注释纠错：解离数据里某个"稀有细胞类型"若在空间上显示只是散落的双联体式分布，而真类型应有清晰的空间结构（如连续的腺体或成片的浸润带），空间证据会直接推翻或坐实注释。分析链条的终局是位置感知的结论：不是"T 细胞存在"，而是"T 细胞聚集在侵袭前沿并紧邻表达趋化因子的巨噬细胞"——后一种说法才配得上机制的标题。

原位式数据的分析差异

原位路线（逐分子成像的一族技术）的数据形态与点阵式不同，分析流程有对应的调整。它的表达矩阵天然是单细胞分辨率——细胞分割由算法在染色图像上完成，每个细胞直接对应一行数据，不需要解卷积；代价是只测几百个预设基因，高变基因选择在这个小面板上进行，聚类分群也要接受"面板外信息不存在"的边界。分析上多出的两个环节值得留意：一是细胞分割质量检查，图像噪声与密集区域会让分割把两个细胞并成一个，边界错误的细胞表达谱是两种细胞的混合，质控时用"细胞面积与 RNA 总量联合分布"能把离谱的分割剔除；二是面板偏差意识，面板没测的基因不参与聚类，某些状态（比如代谢活跃度）在面板式数据里根本不可见，结论要限定在面板覆盖的信号范围内。

常见疑问两则

空间实验要多少重复

空间数据的单元结构与解离数据不同，重复的口径也不同。点阵式一张切片包含成千上万个点，点级统计的功效通常不缺，缺的是生物学重复——结论要跨独立个体成立，至少三个以上供体或独立样本仍是底线，与 4.3 节的伪重复原则一脉相承。原位式还要多算一层：同一张切片上的多个视野共享切割与染色条件，不能当作独立重复。预算有限时的取舍原则：宁可减少每个样本的测序投入，也要保住独立样本数。

图像对齐失败怎么办

表达坐标与染色图像的配准（对齐）是空间数据的独有环节，失败模式是对齐偏移——表达点与形态结构错位半格。轻微偏移对聚类级分析影响有限，但会毁掉单细胞分辨的邻域分析。排查顺序：先检查坐标系的约定（不同导出工具的原点与翻转约定不同，是最常见的乌龙）；再用标志结构人工核对（比如按某个形态清晰的结构看表达信号是否落在对应位置）；仍无法对齐就回到原始坐标做分析，牺牲图像信息保住空间关系——坐标本身才是空间数据不可再生的资产，图像只是辅助层。

本节要点回顾

• 两条路线按问题选：点阵式全转录组画区域地图，原位式面板测到单细胞精度，互补优于二选一。
• 点不是细胞：点阵数据要么按区域解读，要么解卷积拆构成，别把一个点当一个细胞。
• 分析骨架与第三章同源：质控归一化聚类照旧，阈值按平台重估，新增空间邻居图与邻域富集。
• 空间是通讯分析的拼图：配体受体证据加上物理相邻证据，结论才从相关走向机制。

技术与主线到这里全部讲完。第六章离开方法、进入现场：三类真实疾病研究场景里，前面六章的工具如何组合成完整的分析方案。