肿瘤免疫应用：微环境图谱

6.1 肿瘤免疫应用：微环境图谱

本节摘要：肿瘤单细胞分析的核心产出是微环境图谱：哪些细胞在场、各自处于什么功能状态、谁和谁相邻。三个技术要点决定成败——恶性细胞的判定、T 细胞功能状态的细分、以及空间证据对"相互作用"结论的支撑。本节给出一套完整的分析方案与每步的验收要点。

肿瘤标本里的生态

一份肿瘤标本里的细胞大抵分成三方势力：肿瘤细胞本体、浸润的免疫细胞、以及成纤维细胞与内皮细胞构成的基质阵营。图谱化的第一步有一个别处没有的坑——把恶性细胞认出来。上皮来源的肿瘤细胞与正常上皮、甚至与部分基质细胞在标记基因层面高度相似，光靠聚类加注释会把它混进"上皮细胞"里。主流解法是用拷贝数变异做判定：恶性细胞积累着大片段的染色体拷贝异常，把表达谱沿染色体位置平滑后能看出"整段基因同涨同跌"的锯齿模式；inferCNV 与 copyKAT 是这类推断的代表工具，前者需要配对的正常细胞参照，后者可以无监督地直接分出恶性与非恶性别。

import scanpy as sc

# 恶性判定的上游准备：上皮群单独取出做拷贝数推断
epi = adata[adata.obs["celltype"] == "Epithelial"].copy()
# 用 copyKAT 或 inferCNV 对 epi 做推断（R 侧工具），把结果列写回 obs
# scpanel 读入推断结果：
epi.obs["malignant"] = copykat_calls        # 'aneuploid' 为恶性

adata.obs.loc[epi.obs_names, "malignant"] = epi.obs["malignant"]
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恶性细胞判定必须人工复核：看推断出的恶性群是否保留了上皮标记（EPCAM、KRT 系列）、拷贝数锯齿是否明显、以及临床信息（病理报告的肿瘤纯度）是否吻合。判错了这一步，后面所有"肿瘤细胞与免疫的互动"分析都会张冠李戴。

图：肿瘤微环境的阵营与接触面

T 细胞的细分：状态比类型更重要

免疫图谱的解读重心在 T 细胞的功能状态。单看类型（CD4、CD8、调节性 T）不足以解释疗效，同一类型的细胞可以处于截然不同的状态：细胞毒性状态（GZMB、PRF1、NKG7 高）正在执行杀伤，耗竭状态（PDCD1、LAG3、HAVCR2、TOX 高）被慢性抗原刺激磨平了棱角，而干细胞样记忆状态（TCF7、CCR7 高、耗竭标志阴性）被认为是免疫治疗应答的关键储备——耗竭 T 细胞的补给站。分析上这套状态判读就是 3.6 节的注释功夫加 4.3 节的富集：把 T 细胞单独取出重新聚类、对每群跑状态基因集打分、按得分图谱定状态。

三个经典问题用这套图谱回答：其一，应答者与不应答者的图谱差异——治疗前的干细胞样 T 与浆细胞样树突细胞比例常常是应答的阳性信号；其二，新抗原负荷与浸润状态的匹配；其三，耐药机制的空间定位（5.2 节的坐标证据在这里接上：T 细胞"在场"却被基质屏障挡在肿瘤外围，就是 6.1 开头那个经典尴尬的标准答案）。每个问题都需要解离图谱与空间图谱的组合，单靠任何一半都只能说到一半。

基质与髓系阵营的细分

图谱的另外两个阵营各有细分套路与概念陷阱。基质阵营的主角是肿瘤相关成纤维细胞（CAF），它的功能状态谱比"一种细胞"丰富得多：肌成纤维样状态（αSMA 高，织屏障）、炎症样状态（白介素家族高，参与免疫调节）、抗原呈递样状态等，用 4.3 节的差异表达加状态打分就能分出来。髓系阵营的重头戏是肿瘤相关巨噬细胞（TAM），这里有个概念升级值得说：早年沿用体外实验的 M1 与 M2 二分法，在体内图谱里基本站不住——体内巨噬细胞是连续的功能谱，用 M1 与 M2 的基因集打分只能给出两个坐标，而不是两个桶。更好的做法是直接对数据聚类加状态判读，常用的功能轴包括吞噬活性、抗原呈递、免疫抑制（比如 VEGFA 与精氨酸酶通路）。

这两大阵营与免疫治疗的关联越来越被重视：CAF 屏障的密度与 T 细胞浸润受阻相关，抑制性 TAM 的比例与免疫检查点治疗的耐药相关——它们都进得了 6.1 开头那个"应答与不应答图谱差异"的分析框架，扩展成多阵营的分层标志物组合。

从图谱到临床证据的路径

学术图谱与临床可用之间隔着验证链，分析人员要清楚自己的产出站在链条哪一环。第一环是发现：在小队列里找到候选标志（比如治疗前干细胞样 T 细胞比例），这一环本节的方法就够。第二环是验证：在独立的回顾性队列上用可及的检测手段（目标面板测序、多重免疫荧光染色）复核候选标志的分层效力——注意检测手段变了，标志的裁剪也要跟着变，转录组层面的标志要降到能被染色面板捕捉的蛋白。第三环才是前瞻应用：把标志写成预先设定的分层规则放进前瞻研究。多数单细胞分析的产出停在第一环，这完全正当——但报告里要把"这是发现阶段证据"写明白，别让读者误以为分层规则已经能用。

常见疑问两则

冷冻肿瘤样本能不能做

能，路线已经成熟。冻存组织走单核测序（参考 2.1 节），对肿瘤免疫图谱的两个影响要有预期：胞质转录本丢失让部分免疫功能的判读（比如细胞毒性颗粒转录本）灵敏度下降，内含子读段比例升高改变了数据形态；另外核测序测不了表面蛋白，与 CITE-seq 的组合能力受限。冻存样本的价值在 retrospective 队列——能拿到几年前的临床样本与随访结局配对，这对标志验证研究是稀缺资源，核测序的取舍完全值得。

正常对照怎么选

肿瘤研究的对照远比" adjacent normal（癌旁组织）"复杂：癌旁组织已经历肿瘤的 Field 效应（整个区域的微环境被肿瘤分泌信号重塑），拿它当"正常"会低估疾病差异；真正健康的乳腺、肠黏膜组织又涉及获取伦理与可及性。实务方案是分层对照：癌旁组织当疾病背景对照，公开数据库里的健康器官图谱当基线参考，两者共同框定"疾病到底改变了什么"。对照选择的假设要在设计阶段写明——这是肿瘤单细胞研究里审稿意见最密集的位置之一。

本节要点回顾

• 恶性判定是肿瘤数据的第一坑：靠拷贝数推断加人工复核，判错则全线分析张冠李戴。
• 状态比类型值钱：毒性、耗竭、干细胞样三态的比例与互变，比 CD4 与 CD8 的划分更接近疗效机制。
• 空间是相互作用的裁判：配体受体共表达加物理相邻，才构成完整的互作证据链。
• 应答生物标志物从图谱里来：治疗前图谱中的状态比例是最常用的候选分层指标，需在前瞻队列验证。

肿瘤之外，发育与再生是单细胞的另一半主场：那里的核心问题不是"谁在场"而是"谁变成谁"，下节换一副眼镜看同一套工具。