Cell Ranger 计数实操：从 fastq 到矩阵

2.5 Cell Ranger 计数实操：从 fastq 到矩阵

本节摘要：计数软件把 fastq 变成细胞×基因矩阵，核心动作是比对、按条码归组、按 UMI 去重、判定哪些条码对应真细胞。本节给出 Cell Ranger 的完整命令、输出目录的阅读顺序、网页报告里必须核对的指标，并对比 STARsolo 与 kallisto|bustools 两条开源路线。

从 fastq 到矩阵的一条命令

Cell Ranger 是与液滴化学版本配套的官方计数软件，跑一次计数分两步：准备参考基因组（物种参考，人鼠都有现成包可下载），然后执行 count 子命令。下面是一次典型运行的完整会话：

# 第一步：解压现成的参考包（人，GRCh38），只需做一次
tar -xzvf refdata-gex-GRCh38-2024-A.tar.gz

# 第二步：计数。四个关键参数分别指定输出名、参考、fastq 目录、样本名
cellranger count --id=pbmc_run1 \
  --transcriptome=refdata-gex-GRCh38-2024-A \
  --fastqs=./fastqs \
  --sample=pbmc_donorA \
  --expect-cells=8000

# 运行数小时后，输出在 pbmc_run1/outs/ 目录下
​

--sample 参数对应 fastq 文件名里的样本标识，软件靠它在目录里找到属于自己的 reads；--expect-cells 是可选的先验提示，当你对回收量有把握时给出，能帮条码判定更稳——没把握就别给，让它自己从数据里估。输出目录里真正的干货在 outs 子目录：filtered_feature_bc_matrix 是"判定为真细胞"的矩阵（h5 与 mtx 两种格式），raw_feature_bc_matrix 是所有条码的原始矩阵，web_summary.html 是汇总报告，bam 与 molecule_info 存着比对细节与分子级信息，供深度排查使用。

读报告：六个指标定优劣

网页报告信息很多，但定生死的就六项。读的顺序也有讲究——先看细胞数合理不合理，再看质量水位，最后看饱和度：

Fraction Reads in Cells 特别值得多说一句：它衡量所有 reads 里有多大比例落在真细胞条码上。这个值偏低，意味着大量 reads 来自空液滴里的环境 RNA——通常是死细胞释放、或培养上清里的游离 mRNA。数值差到五成以下时，问题在上游而不在参数，换样本比换软件管用。

图：条码排序曲线与细胞判定

细胞判定：拐点背后的两种思路

矩阵里"哪些条码算真细胞"这一步叫细胞判定。最直观的方法是找条码排序曲线的拐点：真细胞条码 UMI 数高、数量少，在曲线上形成陡峭的头部；空液滴靠环境 RNA 攒出几十几百个 UMI，形成又长又平的尾巴。拐点上下就是两群条码的分界。更严谨的思路是空液滴模型：用尾巴条码的背景分布，给每个头部条码算"它是空滴"的概率，只有显著高于背景的才收进 filtered 矩阵——这类方法能捞回拐点法容易漏掉的小细胞（比如血小板、部分淋巴细胞）。

对判定结果不满意时的调节手段有限且有代价：force-cells 类参数可以强制指定细胞数，但那是把你的猜测压过数据的判断，除非有上机记录背书，否则不建议用。分析端更常见的做法是把 raw 矩阵读进来，用分析侧工具重新判定一遍，与官方 filtered 结果对照。

开源替代：两条成熟路线

Cell Ranger 不是唯一选择，两条开源路线已经足够成熟。STARsolo 复用久经考验的 STAR 比对器，加了对条码 UMI 结构的支持，输出格式与官方工具对齐，适合已有比对管线、想精细控制比对参数的团队；kallisto|bustools 走伪比对待路线，不逐碱基比对、直接把片段指派给转录本，速度快一个量级，内存占用也小，适合大规模数据的快速迭代。三个工具在多数常规样本上给出的矩阵高度一致，差异集中在低表达基因与背景估计上。选型建议朴实一点：第一次跑通选官方工具少折腾，建流水线与省钱选开源，两边互相验证也是一种质控。

计数完成后，把 filtered 矩阵读进 Scanpy 只要三行：adata = sc.read_10x_h5("outs/filtered_feature_bc_matrix.h5")，随后 adata.var_names_make_unique() 去掉重复基因名。到这里，细胞×基因矩阵正式到手——第三章开始，全册进入分析主场。

常见疑问两则

计数要跑多久、吃多少资源

以单通道八千细胞、每细胞三万 reads 的常规规模为例，官方工具在十六核六十四 G 内存的机器上跑数小时量级完成，中间峰值内存主要被比对环节吃掉。开源路线的资源需求差着量级：伪比对方案的运行时间可以压到官方工具的零头，一张笔记本就能跑动中等规模样本。规划资源时给参考基因组建库、输出目录（bam 与中间文件动辄几十 G）留足磁盘，比给内存留余量更容易被忽略。

内含子读段要不要统计

默认的计数范围只统计外显子比对，这对常规细胞测序是合理的。但两种场景要改：单核测序数据的转录本大多未完全剪接，内含子读段占比极高，必须打开内含子统计选项，否则矩阵会薄得离谱；研究未剪接转录本的场景（比如要做 RNA 速率分析）也会主动收集内含子。参数是计数软件的一个开关项，跑之前确认它与你的数据类型匹配，比事后发现矩阵异常再排查省得多。

本节要点回顾

• 计数四件事：比对、条码归组、UMI 去重、细胞判定；官方工具与两条开源路线殊途同归。
• 报告六个指标：细胞数、每细胞 reads、中位基因数、有效条码、reads 落细胞比、饱和度，按此顺序读。
• knee plot 会看就够：陡头是真细胞、长尾是空液滴，空液滴模型能捞回更接近背景的小细胞。
• 矩阵进 Scanpy 三行代码：读 h5、基因名去重、看一眼形状，然后进入质控。

矩阵到手还远不能直接用：里面混着死细胞、双联体和空滴残留，表达量还带着测序深度带来的假差异。第三章从质控开始，把这张表逐层洗干净。