单细胞多组学同步检测

5.1 单细胞多组学同步检测

本节摘要：多组学技术在同一细胞里同步读出多层信息——CITE-seq 测转录组加表面蛋白，Multiome 测转录组加染色质可及性。蛋白层补上了"RNA 量不等于蛋白量"的缺口，染色质层补上了"为什么这个基因开"的因果线索。本节讲两条技术的数据形态、各自的归一化要点与联合分析框架。

一种样品多种组学

RNA 丰度是蛋白丰度的间接代理，这个代理有几处系统性失真：转录因子、信号分子这类关键角色，RNA 的微小变化常对应蛋白的剧烈变化；蛋白还受翻译后调控，寿命与修饰都不写在转录组里。CITE-seq 的解法是把带寡核苷酸标签的抗体和细胞一起孵育，抗体结合表面蛋白后与细胞同进液滴，标签序列像 mRNA 一样被测序——一个细胞同时得到转录组矩阵和蛋白丰度矩阵（ADT 层），几十到几百个"蛋白基因"的测量精度远高于从 RNA 推断。它对免疫研究尤其顺手：T 细胞的耗竭标志 PD-1、记忆分型的 CD45RA 之类，都是蛋白层比 RNA 层清晰的经典指标。

Multiome 走另一条路：同一细胞里同时测基因表达（scRNA）与染色质可及性（scATAC）。开放染色质是转录调控的物理基础——增强子开放、转录因子结合位点裸露，基因才可能表达。拿到同一细胞的配对数据，可以直接回答"这个细胞类型里开放的增强子驱动着哪个基因"，把相关证据升级成调控证据，也能给未知亚型找到掌控它的转录因子（与 4.2 节的调控网络互相印证）。

library(Seurat)

# CITE-seq：ADT 层与 RNA 层并存于同一对象
pbmc[["ADT"]] <- CreateAssayObject(counts = adt_counts)
DefaultAssay(pbmc) <- "ADT"
pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "CLR",
                      margin = 2)              # ADT 用 CLR，勿用对数归一化

# 多层联合分群：WNN 按层的信息量自适应加权
pbmc <- NormalizeData(pbmc, assay = "RNA")
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, assay = "RNA")
pbmc <- RunPCA(pbmc, assay = "RNA")
pbmc <- RunUMAP(pbmc, reduction.name = "wnmap", dims = 1:30)
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各层有各层的脾气

多组学分析的第一课是"别把 RNA 的习惯带到别的层"。ADT 层的计数分布与 RNA 完全不同（抗体结合带来的背景与饱和），标准动作是居中对数比率变换（CLR）而非总计数对数化；抗体间还存在溢出（一个抗体信号漏到相近表位），严谨的项目要做溢出校正。ATAC 层的数据是"峰"矩阵（基因组上开放区段的计数），维度高且更稀疏，标准路线是词频逆文档频率变换加潜在语义索引（LSI）降维，另配套生成基因活性矩阵（把峰的信号按距离归并到基因上）用于与 RNA 层对齐。这些层特异流程封装在工具里，但参数含义与失败模式需要你心里有图。

联合分析的框架当前以加权最近邻（WNN）为代表：按各层的信息量自动定权重，算出联合的邻居图用于聚类与可视化——RNA 主导的细胞用它，蛋白或染色质信息更可分的细胞让那层多说话。Python 生态对应的是 MuData（muon 框架），把多层 AnnData 装进一个 MuData 对象，配套 WNN 与各层工具。

时间维度：从状态到谱系

多组学之外还有一条"找回时间"的技术线值得知道。第四章的拟时序是计算推断，谱系示踪则是给细胞装上可读的"里程表"：利用体细胞线粒体突变作为天然条码，或用 CRISPR 编辑条码在细胞分裂时累积可测痕迹，读出细胞之间的真实亲缘关系。谱系信息与转录组叠加后，发育与重编程研究里的"谁变成了谁"从推断变成记录。这条线的分析工具自成体系，常规图谱项目用不到，但读文献遇到 lineage tracing 或 mitochondrial barcoding 字样时应知道它属于这一族——时间分辨的第三种来源，与拟时序、RNA 速率并列。

ADT 层的质控细则

蛋白层有自己的质控清单，照搬 RNA 的习惯必出错。第一项是抗体结合的背景估计：用同型对照抗体（不识别任何目标蛋白的对照）或未标记细胞的信号分布，定出每个抗体的背景水位，专用方法（如 dsb）还会利用空液滴的抗体信号做更精细的背景扣除——这层校正对低表达蛋白的判读影响巨大。第二项是溢出矩阵：荧光流式的补偿逻辑在寡核苷酸标签体系里同样存在，相邻标签的信号串扰要用实验测得的溢出矩阵解开，面板越大这一步越重要。第三项是抗体失效检测：某个抗体信号整体塌陷或飘移（常因运输与储存不当），它的蛋白测量已经失真，识别方法是把各抗体的信号分布画在一起对比——分布异常的那个抗体单独标记不可用，别让它污染联合分析。

Multiome 的 ATAC 侧怎么验收

Multiome 数据的 RNA 侧按第三章常规流程走，ATAC 侧有一套独立的验收指标。核小体条带图谱：合格数据的片段分布应呈现单核小体（约两百多碱基）与游离片段的特征双峰，无峰值结构说明核制备失败。TSS 富集：在转录起始位点周围信号应显著富集（经验合格线在八倍以上），它衡量的是染色质测量的信噪比。FRiP（峰内读段占比）：落在可重复峰内的读段比例反映信噪比的另一面，随实验目的浮动但过低必有问题。三项验收合格的 ATAC 层，才值得进 TF-IDF 加 LSI 的降维流程；不合格时的常见根源在细胞核制备环节，分析端无药可医——又是上游决定上限的例子。

本节要点回顾

• 多组学补 RNA 的两处失真：CITE-seq 用抗体直测蛋白，Multiome 用开放染色质解释调控。
• 各层归一化各有规矩：ADT 用 CLR 加溢出校正，ATAC 用 TF-IDF 加 LSI，套用 RNA 流程必错。
• WNN 是联合分析的代表框架：按层信息量自适应加权，Python 侧对应 MuData。
• 谱系示踪是第三种时间来源：条码累积记录真实亲缘，与拟时序、RNA 速率互为补充。

多组学找回了信息层，欠条还剩一张：空间。下一节看位置信息怎么被测出来，以及空间数据怎么接入你已掌握的分析链。