1.4 覆盖度与测序量估算：30x 是怎么算出来的

1.4 覆盖度与测序量估算：30x 是怎么算出来的

本节摘要：覆盖度决定结论的可信度，也决定预算。本节讲清覆盖度的定义、Lander-Waterman 模型如何把覆盖度翻译成"盲点概率"，并给出常见项目的推荐覆盖度与下机数据量的完整估算过程。

先把术语掰开

覆盖度有两个容易被混用的含义。单碱基覆盖深度：某个位点被多少条独立读长覆盖，是随机变量；平均覆盖度：总碱基量除以基因组大小，是实验设计参数。"30x" 指后者——全基因组平均被盖了 30 层。注意平均数会掩盖局部：由于测序是随机采样，实际深度在均值附近呈泊松分布，有的位置 45 层，有的位置 18 层，还有极少数位置为零层（盲点）。

另一个常被误读的词是"覆盖度 95%"：它不是说每个碱基都被盖到，而是说基因组 95% 的区域至少被一条读长覆盖，剩下的 5% 是盲点。基因组里那些高 GC、高度重复的区域最难测到，它们恰恰是盲点的主要来源。

Lander-Waterman：把运气算成公式

1998 年之前这个模型就建立了（Lander 与 Waterman 在人类基因组计划早期提出），它回答的问题很直接：以随机位置、长度 L 的读长覆盖大小为 G 的基因组，读到平均 C 倍覆盖时，某个位置完全没被覆盖的概率有多大。盲点比例近似等于 e 的负 C 次方：

• C = 5x 时，盲点约 e⁻⁵ ≈ 0.7%；
• C = 10x 时，约 e⁻¹⁰ ≈ 0.005%；
• C = 30x 时，理论盲点已低于亿分之一。

理论公式之外还有现实修正：偏 GC 偏好、重复序列无法唯一定位、mapping 过滤损失，这些都会让有效覆盖低于名义覆盖。工程上的经验是把理论值乘以 0.7 到 0.8 的折扣再去对照需求。这就是全基因组重测序默认 30x、外显子组 100x 以上、临床检测动辄 500x 的由来——不是拍脑袋，而是给"多数表决"留出足够的票数。

图：覆盖度与盲点、可信度的关系曲线

完整估算一次：肿瘤全外显子组项目

把公式用起来。设目标：肿瘤-正常配对全外显子组测序（WES），外显子区约 36 MB（3600 万碱基），要求肿瘤样本有效覆盖 120x。估算顺序如下。

第一步，名义数据量：36 MB × 120 = 4.32 G bp 覆盖外显子区。第二步，回补捕获效率：探针杂交捕获不可能只抓外显子，脱靶加上捕获效率 70% 计，实际需要下机 4.32 / 0.7 ≈ 6.2 G bp。第三步，回补质控损失：过滤低质量读长约损失 10%，需 6.2 / 0.9 ≈ 6.9 G bp。第四步，换算成读长条数：150 bp 双端读长一条贡献 300 bp，约 6.9 G / 300 ≈ 2300 万对读长，对应约 7 GB 的 FASTQ（压缩后）。第五步，换算成订单语言：常见 NovaSeq 通道产量除一下就知道几个样本能拼一个通道，这也是测序公司报价的底层逻辑。

def reads_needed(genome_mb, target_x, capture_eff=1.0, qc_pass=0.9, read_len=150, paired=True):
    """估算达到目标覆盖度所需的双端读长对数与 FASTQ 体量"""
    bases = genome_mb * 1e6 * target_x / capture_eff / qc_pass
    pairs = bases / (read_len * (2 if paired else 1))
    return int(pairs), round(bases / 1e9, 2)   # (读长对数, Gbp)

print(reads_needed(3600, 120, capture_eff=0.7))   # 外显子组 120x
print(reads_needed(3000, 30))                     # 人类全基因组 30x
# 输出：
# (34285714, 10.29)
# (300000000, 90.0)
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常见项目速查与误读

两个高频误读顺带纠正。其一，"测得越深结果越好"只在一定范围内成立：30x 到 60x 对 SNP 检测的增益已经很小，多出来的钱不如换平台或加样本量。其二，RNA-seq 没有"基因组覆盖度"的概念——转录组是动态集合，它的深度指标是比对到基因区的读长条数与基因表达量的饱和曲线，2.6 节展开。

实测覆盖度：名义之外的另一本账

实验做完后要回答的是另一面：实际测到的覆盖度如何、分布是否均匀。工具层面一条命令就能拿到逐碱基深度，再算几项汇总指标：

# 逐碱基深度（BAM 需先排序与建索引）
samtools depth -a sample.sorted.bam > depth.txt
awk '{s+=$3; if($3>=30) c++} END{print "平均深度:", s/NR; print "≥30x 比例:", c/NR}' depth.txt
# 覆盖均匀度常用指标：深度中位数/平均值，以及DepthofCoverage的分位数曲线
​

判读时盯三处。平均深度与订单名义值的差距过大（比如只拿到名义的六成），先看比对率与重复比例——损耗大头常在这里。深度分布的断层（部分染色体整体偏浅）指向拷贝数异常或捕获偏差。局部极端堆积（平均值正常但少数位置深出百倍）通常是重复序列或引物伪影，变异检测会过滤它们，但定量类分析要另行处理。这几项检查做完，你对"这份数据能支撑什么强度的结论"就有了量化底气——这正是第 2 章所有下游分析前应有的健康证明。

覆盖度的两条口径陷阱

谈覆盖度还有两个口径问题，合同与报告里经常打架。其一是"原始数据量"与"唯一比对数据量"：测序公司按下机碱基量交付，而你能用的只有比对到基因组的部分——重复读长、低质量读长、未比对读长都要扣除，签合同时应约定按比对后口径验收，或至少注明名义深度的折扣预期。其二是"全基因组平均"与"目标区域覆盖"：外显子组项目的名义深度算在捕获区上，捕获区外的测序量是"陪跑"的；看覆盖报告要盯目标区间的 20x 覆盖比例（外显子组通常要求 95% 以上），而不是笼统的平均值。

统计口径之外还有一个生物口径：肿瘤样本的覆盖度要求还叠加了纯度与倍性——肿瘤细胞只占样本的一部分、基因组倍性又不是整齐的两倍，同样 150x 的名义深度摊到肿瘤细胞的等位基因上可能只有几十倍。这就是临床样本报告里必须同时给出肿瘤纯度与有效深度的原因：覆盖度从来不是一个数字，而是一组口径明确的数字。

到这里，第 1 章的问题——数据长什么样——已经有了完整答案：FASTQ 容器、质量标尺、读长尺度、覆盖深度。第 2 章开始动手加工这些数据。